ContinuarCapítulo 1:
Observación de microorganismos
Sección
3: Técnicas de observación de microorganismos
Las preparaciones en fresco se realizan colocando una gota de líquido con los microorganismos entre un porta y un cubre. Permiten observar microorganismos vivos pero dado el poco contraste que los microorganismos presentan con respecto al medio que los rodea suelen ser muy poco útiles en microbiología. Se han utilizado para observar protozoos móviles como le patógeno Trichomonas vaginalis.
Teñir los microorganismos proporciona suficiente contraste para poder visualizarlos con un microscopio de campo claro. Casi todos los colorantes son sales, es decir están formados por iones cargados.
Algunos pueden utilizarse a concentraciones que no matan las células con lo que permiten observar microorganismos vivos (Colorantes Vitales) pero la mayoría sólo son efectivos después de fijar los microorganismos, es decir cuando están muertos y adheridos al portaobjetos.
Los colorantes más utilizados son colorantes básicos, la parte que proporciona el color está cargada positivamente. Se utilizan estos colorantes porque las células bacterianas están débilmente cargadas en su superficie con cargas negativas. Los más utilizados son el Cristal Violeta, el Azul de Metileno y la Safranina.
Los Mordientes, como el Lugol, son sustancias que aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Suelen añadirse después del colorante en determinadas tinciones diferenciales
En las tinciones simples se usa un único colorante de carácter básico. Todas las células de la preparación quedan teñidas y se observan del mismo color. Se realiza la fijación, por calor, de la muestra al portaobjetos. Se añade el colorante y se deja actuar el tiempo necesario para que se absorba. Posteriormente se retira el exceso de colorante y la preparación está lista para ser observada.
Las tinciones diferenciales se utilizan para distiguir entre tipos de microorganismos. Se basan en el uso de dos colorantes. Se realiza una tinción primaria, con la misma técnica de la tinción simple y posteriormente una tinción de contraste para teñir las células que no se hayan teñido previamente. La tinciones diferenciales más importantes son la tinción de Gram y la tinción de Ácido-Alcohol Resistencia
La tinción de Gram, diseñada en 1884 por el bacteriólogo danés Christian Gram clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: Gram Positivas y Gram Negativas. Esta tinción diferencial depende de la estructura de la pared celular de las bacterias.
Las bacterias Gram negativas tienen una membrana externa de la que carecen las bacterias Gram positivas.
La técnica consiste en una tinción primaria, una decoloración y una tinción de contraste.
La tinción primaria se realiza con Cristal Violeta que tiñe a todas las bacterias. Posteriormente se añade un mordiente (Lugol, que es un compuesto de Yodo) que intensifica la tinción.
La decoloración se realiza con etanol o acetona. En este momento las bacterias Gram negativas se decoloran, pierden su color violeta, mientras que las células Gram positivas retienen el clorante debido a las especiales características de su pared celular.
Como colorante de contraste se añade safranina que tiñe de rosa las bacterias decoloradas gram negativas.
Esta tinción permite diferenciar micobacterias, bacterias con ácidos micólicos en su pared celular pertenecientes a los géneros Mycobacterium y Nocardia. Los ácidos micólicos hacen que las microbacterias resistan, no sólo la decoloración con alcohol como las Gram positivas sino la decoloración con una mezcla de ácido y alcohol capaz e decolorar al resto de las Gram positivas.
La tinción primaria se realiza con Fuscina básica que tiñe las células de rojo.
La decoloración se realiza con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Esta mezcla elimina la fuscina de todas las células excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie cérea, de ácidos micólicos.
Como colorante de contraste se utiliza Azul de metileno que tiñe las células previamente decoloradas de azul.
Las tinciones específicas revelan estructuras celulares. Se pueden teñir selectivamente las esporas, los flagelos o las cápsulas.
La tinción de Wirtz-Conklin permite diferenciar las esporas de las células vegetativas. La tinción primaria se realiza con Verde de Malaquita en caliente que tiñe las células de verde. El calor es necesario para que las endosporas se tiñan. Si la preparación se lava con agua, sólo las células vegetativas se decoloran mientras que las esporas retienen el color.
La tinción de contraste se realiza con rosa safranina que tiñe las células vegetativas de color rosa, mientras que las esporas permanecen verdes.
La tinción de flagelos de Leifson es una tinción simple que usa un colorante, la rosanilina y ácido tánico que engrosa los flagelos para que puedan verse. Es imprescindible fijar las células con formol y realizar la tinción muy cuidadosamente para poder observar los flagelos.
La mejor técnica para visualizar cápsulas se basa en realizar una tinción negativa utilizando tinta china o nigrosina, colorantes que no penetran en la célula sino que ennegrecen el medio. Las células se observan brillantes, sin teñir y se aprecia una zona clara alrededor de las mismas. En ocasiones se utiliza un colorante posterior para resaltar las células. En la foto Streptococcus pneumoniae.
Como ya hemos mencionado pueden realizarse tinciones de microorganismos con sustancias simples fluorescentes o con anticuerpos unidos a sustancias fluorescentes que deben observarse en microscopios especiales de fluorescencia.
