ContinuarCapítulo 4:
Cultivo de virus
Sección
2: Cultivo de virus animales
Para cultivar los virus patógenos humanos se requieren utilizar las células hospedadoras específicas para los mismos y que suelen ser de diferentes tipos.
Los animales se emplean en el aislamiento e identificación de los virus, si bien su importancia se restringe cada vez más por los avances logrados con los cultivos de tejidos y células. Se emplean monos, vacas, conejos, aves, ratas y ratones; estos últimos más que ningún otro.
Las vías de inoculación son diversas (intracerebral, nasal, peritoneal, venosa, dérmica y por escarificación), y las cantidades a inyectar varían con las vías de administración.
La acción se manifiesta por lesiones locales y síntomas generales, cambios patológicos dependientes del tipo de virus (vesículas, neumonías, encefalitis, cuerpos de inclusión, meningitis y otros).
El embrión de pollo o huevo embrionado proporciona una gran variedad de tipos celulares que son susceptibles a muchos virus animales.
Cuando se inocula al embrión de pollo por diferentes vias pueden alcanzarse diversos tipos celulares por lo que se utiliza en el aislamiento de virus, titulación o enumeración de virus y mantenimiento de cepas víricas.
Se emplean huevos con cinco a 14 días de incubación, según la vía de inoculación: membrana conoalantoidea, cavidades alantoidea y amniótica, saco vitelino, o bien, intracerebral o endovenosa.
La reproducción viral se comprueba por lesiones locales sobre la membrana corioalantoidea y su engrosamiento (vacuna, viruela, herpes simple), desarrollo de hemaglutininas (influenza, Newcastle), muerte del embrión, a veces con aspecto congestivo y hemorrágico (encefalitis equina, influenza) y pruebas conexas, cuando no hay cambios patógenos apreciables (poliomielitis).
Las células se cultivan en un recipiente de plástico ordinario -matraces, botellas o placas de Petri- con un medio complejo suplementado con suero. Dichas células pueden mantenerse en suspensión mediante agitación o pueden prepararse en monocapa.
Para obtener subcultivos, se disgregan las monocapas en células individuales sin que sufran daño, mediante un tratamiento suave con la enzima proteolítica tripsina, que disuelve las proteínas que mantienen las células unidas entre sí.
Los cultivos celulares se denominan de acuerdo con su origen (animal y órgano o tejido), su número de cromosomas y según el tiempo que pueden multiplicarse en el laboratorio.
Los cultivos celulares primarios se inician a partir de un tejido normal, tomado directamente de una persona o de un animal.
Después de varios subcultivos, las células que crecen mejor comienzan a predominar en el medio. Se les denomina líneas celulares porque derivan de las células que mejor se adaptan al crecimiento en cultivo.
Si la línea celular contiene el mismo número de cromosomas que las células somáticas de la especie de la cual se obtuvieron se llama línea celular diploide; si posee un número diferente se llama línea celular heteroploide.
La mayoría de las líneas celulares diploides, incluidas las de la especie humana, comienzan a crecer de una manera lenta después de 20 ó 30 subcultivos y, ocasionalmente, pierden su habilidad para mantener la multiplicación vírica.
En contraste, algunas líneas celulares, normalmente obtenidas de un tejido canceroso, pueden crecer indefinidamente. A estas se les denomina líneas celulares continuas. La línea celular continua más famosa está constituida por células HeLa (por Helen Lack, la donante) y ha sido cultivada desde 1951 de forma continua en varios laboratorios de diversas partes del mundo; se obtuvo a partir de un cáncer de útero humano.
La multiplicación intracelular del virus da lugar a cambios o efectos citopáticos que varian según el tipo de virus: cuerpos de inclusión intranucleares y citoplásmicos, núcleo picnótico, células gigantes multinucleadas, degeneración o hipertrofia del protoplasma, etc. Tanto el crecimiento celular como los cambios citopáticos pueden observarse al microscopio.
La proliferación de ciertos virus que no modifican la estructura de las células se comprueba por hemabsorción de glóbulos rojos de diferentes especies (cobayo, pollo, ganso, rhesus); en otros casos, la presencia de antígenos fijadores del complemento también demuestra la reproducción viral. Es posible advertir la detención del metabolismo y la consecutiva destrucción celular, añadiendo un indicador de pH (rojo fenol) que al colorearse de amarillo indicará la acidez correspondiente a la actividad normal, y con el rosado o neutro, el cese de la actividad metabólica.
Los cultivos celulares han simplificado enormemente la investigación de los virus y prácticamente han reemplazado el empleo de animales de experimentación, como forma de detección e identificación de los virus de animales.
A pesar de los evidentes avances realizados en los últimos 30 años, los métodos de aislamiento de los virus así como el diagnóstico de las enfermedades víricas no han cambiado demasiado. Los cultivos celulares son tan lentos que no se realizan como método de aislamiento ni como paso previo a la prescripción de un tratamiento terapéutico. Por ello en el análisis virológico rutinario del agua se acude al cultivo de bacteriófagos como sistema indicador de contaminación fecal viral.
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