OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS (pp. 48-63)

1. Aunque los microorganismos pueden ser vistos y cultivados, sabemos pocas cosas acerca de ellos.


Las propiedades de la luz (pp. 48-50)

1. La luz es aquella parte del espectro de ondas electromagnéticas que es visible para el ojo humano.

2. La longitud de onda es la distancia entre dos picos o entre dos valles de una onda. La intensidad de una onda luminosa es la altura de esa onda.

3. Si un rayo incide en un objeto y es devuelto, se dice que se ha reflejado; si pasa a través del objeto, se ha transmitido; si transfiere parte de su energía a dicho objeto, ha sido absorbido.

4. Cuando la luz pasa a través de una pequeña abertura o alrededor de un objeto opaco, se desvía; a esta desviación se le llama difracción.

5. La refracción es la desviación que tiene lugar cuando un rayo de luz penetra, formando un angulo, en un objeto de diferente densidad.


La microscopia (pp. 50-52)

1. En todos los microscopios, la calidad de la imagen depende de tres factores. El aumento es la amplificación de un objeto. El contraste es la diferencia de intensidad luminosa. Una buena resolución significa ser capaz de percibir dos puntos adyacentes de una imagen como separados uno del otro.

2. El poder de resolución de un microscopio se puede aumentar usando lentes de aumento de mavor tamaño, iluminando el espécimen con una luz de menor longitud de onda, o usando un material (como el aceite de inmersión) con un índice de refracción mayor que el del aire, entre la lente del objetivo y la preparación.

3.La apertura numérica (AN) es una medida del tamaño de la lente del objetivo y depende de si la lente va a ser usada con aceite de inmersión

 

El microscopio óptico compuesto (pp. 52-53)

1. Un microscopio óptico utiliza la luz visible como fuente de iluminación. Un microscopio óptico compuesto posee dos sistemas de lentes, la lente del ocular y la lente del objetivo. Otro sistema de lentes, el condensador, dirige la luz a través del espécimen. La luz transmitida por el espécimen forma una imagen en el tubo del microscopio; ésta es aumentada por la lente ocular y proyectada en la lente del ojo.

2. Los microscopios ópticos compuestos están provistos de varios objetivos: débil seco (l0X), fuerte seco (40X), y el objetivo de inmersión (l00X).

3 Un microscopio óptico ordinario produce una iluminación de campo claro, la luz pasa a través del espécimen y el campo se observa iluminado de forma brillante.



Preparaciones en fresco (pp. 54-55)

1. Una preparación en fresco se emplea para observar microorganismos vivos. Un preparación en gota pendiente evita la desecación y puede ser observada durante más tiempo. Ninguna de ellas aporta mucho contraste.


Tinciones (pp. 55-59)

1. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. La mayoría sólo son efectivos si los microorganismos han sido fijados: muertos y adheridos al portaobjetos. Los colorantes básicos son iones cargados positivamente, y los ácidos negativamente.

2. Un mordiente es un compuesto que aumenta la afinidad del espécimen por el colorante o que recubre la estructura para hacerla mas visíble.

3. Una tinción simple utiliza un solo colorante. Una tinción diferencial consta de dos etapas, una tinción primaria y una de contraste.

4. La tinción de Gram es diferencial y distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, debido a sus distintas superficies externas.

5. La tinción de ácido-alcohol resistencia o de Ziehl-Neelsen es diferencial y tiñe las micobacterias de rojo, mientras que la otras bacterias son teñidas de azul por el colorante de contraste.

6. La tinción de Wirtz-Conklin tiñe las endosporas, estructuras de reposo de algunas bacterias. La tinción de Leifson utiliza colorantes y mordientes para teñir los flagelos, apéndices filamentosos para la motilidad. La tinción negativa se utiliza para observar la cápsula, una estructura protectora de algunas bacterias.


Microscopia óptica: otras formas de lograr el contraste (pp. 59-60)

1. En la microscopia de contraste de fases, el contraste se debe a que los diferentes materiales absorben diferentes cantidades de luz. Debido a que puede utilizarse con células vivas sin teñir, puede usarse para estudiar el movimiento celular. Dado que no existe distorsión debida a la fijación o tinción, es una técnica muy buena para observar detalles internos. Pero se observa un halo de luz alrededor de la imagen, que es inevitable.

2. En la microscopia de campo oscuro, la imagen se ve brillante contra un fondo oscuro. Se puede utilizar con células vivas sin teñir.

3. La microscopia de fluorescencia incrementa el contraste por medio de la fluorescencia, y, además de servir para observar microorganismos, se puede utilizar para identificarlos. Las técnicas con anticuerpos fluorescentes (o inmunofluorescencia) son importantes herramientas de diagnóstico.

4. La microscopia de Nomarsky proporciona contraste por interferencia, como lo hace el contraste de fases, pero produce una imagen semejante a las tridimensionales, con más detalle.

 

Microscopia electrónica (pp. 60-63)

1. El microscopio electrónico posee un poder de resolución mayor, y por tanto un mayor aumento útil que el microscopio óptico.

2. El microscopio electrónico de transmisión (MET) utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto. Produce aumentos de hasta 200000x (en comparación con los 1000x para un microscopio óptico).

3. El MET requiere que las muestras reciban una preparación especial, como la sección fina, la criofractura o el criograbado; a menudo se aumenta el contraste por sombreado metálico, utilizando un metal pesado.

4. El microscopio electrónico de barrido (MEB) bombardea la superficie del espécimen con un rayo de electrones de tal manera que produce imágenes con una profundidad aparente tridimensional.

5. Las muestras para microscopia electrónica de barrido deben ser congeladas y desecadas al vacío y después recubiertas con un metal pesado. Los especímenes son observados al vacío. El MEB se utiliza generalmente para visualizar células enteras, pero la criofractura y el criograbado también permiten observar estructuras internas.

Aplicaciones de la microscopia (pp. 63)

1. Generalmente, los microscopios de uso cotidiano son los ópticos, ya que proporcionan una buena información acerca del tamaño, forma y apariencia general de las células; sin embargo, la resolución, y por tanto también el aumento, son limitados.

2.Los microscopios electrónicos, que permiten visualizar la ultraestructura celular, se utilizan en investigación. Los virus y los objetos más pequeños, como las macromoléculas, sólo pueden verse mediante microscopios electrónicos.

 
CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS (pp. 63-74)

1. Los microorganismos son sujetos ideales para la investigación en el laboratorio porque se pueden estudiar millones de ellos en un solo mililitro de medio, porque se multiplican rápidamente, y porque los conocimientos adquiridos pueden, a menudo, generalizarse a sistemas celulares, plantas y animales (incluida la especie humana).

 

Obtención de un cultivo puro o axénico (pp. 63-64)

1. Un cultivo axenico consiste en un solo tipo de microorganismo derivado de una sola célula. En la naturaleza existen cultivos mixtos.

La esterilización (pp. &4~6)

1. La primera etapa para obtener un cultivo axénico es la esterilización: eliminación de todos los microorganismos de un material. Todos los instrumentos y materiales utilizados para obtener un cultivo axénico deben ser esterilizados, incluyendo el medio de cultivo.

2. La esterilización por calor mata los microorganismos por desnaturalización de sus proteínas. El calor húmedo es más rápido que el calor seco, pero se requiere una temperatura mayor que la del punto de ebullición del agua; normalmente se utiliza la autoclave.

3. El calor seco se utiliza para materiales que se dañan por la humedad. Se necesitan temperaturas de al menos 1700C y un tiempo mínimo de una hora. El flameado directo es otra forma de esterilización por calor seco.

4. La filtración es el paso de un fluido a través de una barrera con poros demasiado pequeños para las células microbianas. La filtración no elimina los virus porque pasan a través de los filtros.

5. La esterilización química se utiliza para destruir los cultivos después de un experimento y para minimizar la contaminación en el laboratorio.

 

El aislamiento (pp. 66-67)

1. La segunda etapa para obtener un cultivo axénico es inocular, o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio estéril. Un clon es una población celular descendiente de una sola célula. Las colonias son clones que han crecido sobre un medio sólido el tiempo suficiente como para hacerse visibles.

2. Las células de un cultivo deben diluirse previamente, para poder aislar una de ellas.

3. En el método de siembra por estría en placa, se sumerge el asa en el cultivo mixto y se hacen estrías sobre un medio sólido en placa Petri. El proceso se repite hasta que se aíslan células individuales. Se incuban las células basta que se observan las colonias. Entonces, se repite el proceso.

4. En los métodos de siembra por vertido en placa y extensión en placa, las suspensiones de células microbianas se diluyen anies de ser sembradas. A continuación se pueden seguir dos técnicas distintas; o bien las diluciones se mezclan con agar fundido y se vierten en placa, o bien se siembran en la superficie de una placa de agar, extendiéndolas con una asa de vidrio. Las placas se incuban hasta que aparecen las colonias. A continuación, se repite el proceso.

 

El crecimiento de los cultivos axénicos (pp. 67-70)

1. Un medio definido se prepara a partir de productos químicos puros. Los microorganismos exigentes requieren medios químicamente complejos. La preparación de los medios definidos es laboriosa y las bacterias suelen crecer en ellos más lentamente que en los medios complejos.

2. Los medios complejos se preparan a partir de extractos de substancias naturales como la carne, la sangre o la caseína. A un medio líquido complejo se le llama caldo. Los medios complejos son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.

3. Los medios Selectivos favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprimen el de otros. Se utilizan para aislar una especie concreta, a partir de una mezcla compleja.

4. Los medios diferenciales, como el agar sangre, se utilizan para la identificación de las colonias de un tipo concreto de microorganismo. Los medios selectivos-diferenciales reducen el campo de identificación e identifican una bacteria específica.

5. Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un microorganismo particular o un tipo microbiano a partir de una población natural grande y compleja.

 

Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio (pp. 70-72)

1. En general, los microorganismos crecen más rápidamente a temperaturas medias. Para disminuir los cambios de pH, generalmente se adicionan tampones a los medios.

2. Los microorganismos aerobios estrictos requieren oxígeno para obtener energía. Los anaerobios estrictos no pueden crecer en presencia de oxígeno. Los microorganismos anaerobios facultativos utilizan oxígeno si disponen de él, pero no lo necesitan. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxigeno, pero tampoco les perjudica. Los microaerófilos requieren bajas tensiones de oxígeno. Suministrar o excluir el oxigeno de un medio siempre representa un problema técnico.

 

Conservación de los cultivos axénicos (P 72)

1. Los cultivos que se conservan para su estudio y como cepas de referencia; se les llama cultivos de colección.

2. Se puede mantener un cultivo desecándolo (eliminación total del agua). Como técnica de desecación suele usarse la liofilización. Los cultivos también se pueden preservar a bajas temperaturas. Tras la congelación, el cultivo se almacena a 100C, bien en nitrógeno líquido o en un ultracongelador.

 

Microorganismos que no pueden ser cultivados en el laboratorio (pp. 72-73)

1. Muchos microorganismos no pueden cultivarse en el laboratorio, incluyendo las bacterias que causan la sífilis y la enfermedad de Hansen (lepra).

2. Las riquetsias, clamidias y todos lo virus requieren ser cultivados en sus células hospedadoras vivas. Se pueden utilizar animales vivos o cultivos de tejidos.


 

PREGUNTAS DE REVISIÓN

 

OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

1. ¿Por qué es importante entender las propiedades de la luz para el estudio de los microorganismos? ¿Qué es la luz?

2. Explique esta afirmación: Cuando un rayo de luz incide frontalmente en un objeto, pueden suceder tres cosas.

3. Defina los siguientes términos: reflexión, difracción, refracción, índice de refracción.

4. La utilidad de todos los microscopios depende de tres propiedades: aumento, contraste y resolución. Explique en qué consisten.

5. ¿Qué es el poder de resolución de un microscopio? ¿Cómo puede aumentarse? ¿Qué es la apertura numérica (AN) de una lente del microscopio?

6. Haga un boceto de un microscopio óptico y señale las siguientes partes: objetivo, ocular, condensador, tubo,

7. Explique por qué un microscopio óptico compuesto posee sistemas de lentes y lentes correctoras. ¿Qué es la iluminación de campo claro?

8. Explique cómo se realizan una preparación en fresco y una en gota pendiente ¿Cuáles son las ventajas e inconvenientes de estas observaciones.,

9. ¿Cuáles son las ventajas e incovenientes de teñir una muestra?

10. Defina los siguientes términos: colorante ácido, colorante básico y mordiente.

11. Explique la diferencia entre los siguientes tipos de tinciones: sencilla, diferencial, Gram, ácido-alcohol resistencia (tinción de Ziehl-Neelsen).

12. ¿Qué es una tinción específica? Diga para qué se utiliza la tinción de Wirtz-Conklin, la de Leifson y la tinción negativa.

13. Compare los distintos tipos de microscopios ópticos. Describa sus fundamentos, el tipo de imagen que producen y sus ventajas e inconvenientes.

14. Haga lo mismo que en la pregunta 6 pero referido a los dos tipos de microscopios electrónicos. Describa también las técnicas de preparacion: sección ultrafina, criofractura, criograbado y criosecado.

15. En general, ¿cuáles son los usos de la microscopia óptica y electrónica.

 

EL CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS

1. ¿Cuáles son las ventajas e inconvenientes del pequeño tamaño de los microorganismos a la hora de su cultivo?

2. ¿Qué es un cultivo axénico? ¿Cuáles son las dos etapas básicas en la obtención de un cultivo axénico?

3. Delina qué es la esterilización. ¿Cuáles son los diferentes usos de la esterilización por calor y la esterilización por compuestos químicos? ¿Cuáles son las ventajas e inconvenientes de la esterilización por calor seco y húmedo? ¿Qué precauciones especiales hay que tomar al esterilizar en la autoclave?

4. Describa la esterilización por filtración. Se trata realmente de un proceso de esterilización? Explíquelo. ¿Para qué se utiliza en el laboratorio?

5. Defina los siguientes términos: inoculación, clon, colonia, incubación, dilución, diluciones seriadas.

6. Describa cómo se llevan a cabo los distintos métodos de aislamiento; siembra en estría, vertido en placa y siembra en superficie.

7. Compare los siguientes tipos de medios de cultivo: definido, complejo, selectivo, diferencial, selectivo-diferencial, de enriquecimiento.

8. ¿Qué importancia tienen la temperatura, pH y el oxígeno en el cultivo de los microorganismos.

9. Defina los siguientes tipos de microorganismos: aerobios estrictos, anaerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes, microacrofilos.

10. Explique cómo se conservan los cultivos mediante desecación y por almacenamiento a bajas temperaturas.

11.¿Existen microorganismos que no se puedan cultivar en el laboratorio? Explíquelo y de algunos ejemplos.

 

 

LECTURAS RECOMENDADAS

American Society for Microbiology. 1993. Methods of general microbiology. Washington, D.C.

Balows, A.; Hausler, W. J. Herrmann, K. L.; Isenberg, H. D. y Shadomy, H. J. 1991. Manual of clinical microbiology. 5ª ed. Washington D.C.: American Society for microbiology.

Block, S. S. 1991 Disinfection, sterilization, and preservation. Philadelphia: Lea aud Febiger

James, J. y Tanke, H. J. 1991. Biomedical light microscopy. Boston: Kluwer.

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