Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías (Capítulo 23). Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo seran.

Medios de enriquecimiento Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación (Capítulo 29).

Las diferentes formas químicas de los nutrientes que necesitan los diferentes tipos de microorganismos para crecer se trataran en el capitulo 8.

Tabla 3.6. Ingredientes del caldo nutritivo, un medio complejo adecuado para el cultivo de muchas especies de bacterias
Ingrediente	Cantidad	Comentarios
Peptona	5 g	Caseína parcialmente ludrolizada por tripaina
Extracto de carne	3 g	Concentrado desecado de un extracto de carne en agua caliente
NaCl	8 g	Aliadido como osmorregulador
Agua destilada	1000 mL

3.2.5 Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambien es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado.

Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo (Capítulo 8). Pero, en general, los microorganismos crecen mas rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas (Capitulo 2). Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación (Capítulo 5), se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37 oC, la temperatura del cuerpo humano.

Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baños de agua, ambos controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petrí, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuídos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo.

Figura 3.21 Medio diferencial. Streptococcos pyogenes se diferencia de otras bacterias porque en agar sangre lisa los hematíes creando una zona clara alrededor de cada colonia.

pH El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.

Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones (Capítulo 2). En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósboro y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores.

Oxígeno La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano (Capítulo 8). Algunos microorganismos, a los cuales se denomína aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno.

Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más dificil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profunditíad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafio para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire.

La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petrí, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se hava eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reaccion consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para dismínuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhidrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece (Figura 3.22).

Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas (Figura 3.23). Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno.

Figura 3.22 El oxígeno debe ser suministrado, eliminado o restringido dependiendo de los requerimientos de los microorganismos. Para los microaerófilos (que requieren bajas tensiones de oxígeno) y para los anaerobios aerotolerantes (que pueden crecer en presencia de oxígeno o en su ausencia) se utilizan recipientes cerrados con una vela en su interior.

3.2.6 Conservación de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. Muchos laboratorios poseen una colección dc cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.

Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vacio para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente.

Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.

Figura 3.23 Cámara líbre de oxígeno. Los microorganismos anaeróbiros estrictos mueren cuando se exponen al oxígeno, incluso cuando la exposición es breve. Normalmente son suficientes procedimientos menos complejos.

3.2.7 Microorganismos que no pueden ser cultivados en el laboratorio

Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en un medio artificial. De hecho, se cree que sólo una mínima cantidad de las especies que existen en la naturaleza, pueden cultivarse en el laboratorio. Se pueden tomar muestras de suelo y contar el número de microorganismos con la ayuda de un microscopio. Si posteriormente se cultivan esas muestras, creceran menos de la mitad de los organismos observados, independientemente de la técnica que se utilice.

Algunas de las bacterias que causan enfermedades extremadamente serias no han podido cultivarse en medios de laboratorio pero puede hacerse en animales de experimentación. Por ejemplo, Treponema pallidum, causante de la sífilis, enfermedad de transmisión sexual, se cultiva en conejos (Capítulo 24); Micobacterium leprae, agente causal de la enfermedad de Hansen (lepra), se inocula en armadillos (Capitulo 26). Las riquetsias y clamidias (Capítulo 11) y todos los virus requieren ser cultivados en sus células hospedadoras vivas, ya que son parásitos intracelulares obligados. Además de animales vivos, también pueden utilizarse cultivos de tejidos, cultivos de células animales.

Con muy pocas excepciones, los microorganismos que no han podido cultivarse en el laboratorio, no han sido identificados. No sabemos cuántos de estos misteriosos seres existen o qué importancia puedan tener. Es de esperar, sin embargo, que con los modernos avances de la ingeniería genética, seamos capaces de identificar e incluso clasificar estos microorganismos en especies simplemente obteniendo pequeños fragmentos de sus genes. Cuando esto suceda, será posible el estudio de los microorganismos sin necesidad de cultivarlos.

Y crecieron felices para siempre

Douglas Nelson, un microbiólogo de nuestros días, quería cultivar la bacteria Reggiatoa. Este microorganismo es muy interesante por la forma en que obtiene energía: oxida compuestos reducidos de azufre. Nelson sabía que la bacteria crecía y se multiplicaba en presencia de ácido sulfhídrico y oxígeno y unos pocos nutrientes más. Pero también conocía que estos gases eran incompatibles, ya que reaccionan entre sí espontáneamente, coexistiendo sólo durante un corto período de tiempo. Nelson tuvo una idea: usaría un gel de agar. Aunque un gel de agar es bastante consistente, está compuesto mayoritaríamente por agua, por tanto disuelve fácilmente las sustancias que difunden a su través. ¿Por qué no hacer que el ácido sulfhídrico difundiera hacia la bacteria desde una dirección y el oxigeno desde otra, y los dos gases se encontraran donde el microorganismo pudiera usarlos? Nelson llenó un tubo de ensayo con agar y puso en el fondo del mismo sulfhídrico; a continuación inoculó la bacteria y dejó la parte superior del tubo en contacto con el aire. Su plan funcionó. El ácido sulfhídrico difundió hacia arriba y el oxígeno del aire hacia abajo y Beggiatoa creció en una fina línea, que era la zona donde se encontraban ambos gases, aproximadamente en la mitad del tubo.

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