Dicho error es la imprecisión que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se hagan las disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la población total en conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrán más células que otras, pero en el 95 por ciento de los casos, el número real de células viables no difiere del número determinado en más del doble de la raíz cuadrada del número de colonias recontadas.

Figura 8.10 El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el número más probable de células estadisticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.

8.4.6 Número más probable

El método del número más probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacion una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede determinar el numero más probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadística. La Tabla 8.6 muestra una tabla del NMP.

La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilución se considera como una relación apropiada entre la precisión y la economía. El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido detcrminado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

8.4.7 Filtración

Los métodos que dependen de la formación de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez (número más probable) pueden detectar una única célula microbiana viable, pero debido a razones prácticas, sólo se utiliza alrededor de un mililitro de la muestra corno inóculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro. Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe concentrarse antes de proceder al recuento. La concentración de los microorganismos de las muestras se hace, generalmente, mediante filtracion síguiendo el mismo método descrito en el Capitulo 3. Para ello, se hace pasar un volumen conocido de líquido o de aire a través de un filtro de membrana, haciendo vacio. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeños como para que no puedan pasar las células microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio sólido adecuado y se incuba. El número de colonias que se desarrollan es el número de células microbianas viables en el volumen de fluido que se filtró. Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 8.11).

Los diversos métodos de determinación del número de microorganismos se resumen en la Tabla 8.7.

RESUMEN

LAS POBLACIONES (p. 192)

1. El crecimiento microbiano se refiere al crecimiento de una poblacion - un aumento en el número de células, no un aumento en el tamaño de una célula individual.

Figura 8.11 Filtración.

CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS (pp.192-196)

1. El tiempo de duplicación es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente.

2. La tasa de crecimiento se mide normalmente como el tiempo de duplicación por hora.

3. El crecimiento exponencial significa que durante cada tiempo de duplicación, el número de células de la población se incrementa por un factor de dos. La fórmula es N = 2ⁿ, donde N es el número de células en el cultivo después de que han pasado n tiempos de duplicación.

4. El crecimiento microbiano se representa gráficamente en una escala logarítmica.

5. Un cultivo microbiano pasa típicamente por cuatro fases distintas de crecimiento: la fase lag, la fase log, la fase estacionaria y la fase de muerte. Las fases lag y de muerte no se producen a veces en un cultivo determinado.

6. Generalmente, la fase lag se produce cuando las células en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Es un período de no crecimiento, pero existe una actividad metabólica considerable, ya que las células se preparan para crecer.

7. La fase log no continúa indefinidamente debido a factores como la reducción de nutrientes o a la acumulación de productos tóxicos.

8. Durante la fase estacionaria no se produce un incremento neto de la masa, pero las células se hacen más pequeñas y sintetizan componentes que les ayudan a sobrevivir durante los períodos de no crecimiento.

9. Durante la fase de muerte, las células mueren exponencialmente, pero a una tasa más baja de la que crecen en la fase log. Generalmente la muerte se produce porque las células agotan sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los componentes celulares.

10. En condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua en el ambiente de una célula a bajas concentraciones, de manera que la tasa de crecimiento es fijada por la concentración del nutriente mas escaso, o nutriente limitante.

11. En el laboratorio, se consigue un cultivo continuo con un quimiostato. La concentración del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo.

12. Las células de una colonia están en fases diferentes de crecimiento dependiendo de su localización. Las células que crecen en la superficie de una colonia son acróbicas y las que están en el centro son anaeróbicas.

¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER? (pp. 196-203)

Nutrición (pp. 196-201)

1. Los nutrientes son compuestos químicos procedentes del medio ambiente que son utilizados por una célula para sintetizar las moléculas necesarias para fabricar nuevas células.

2. Todos los microorganismos requieren una fuente de carbono para crecer, porque el carbono es la base estructural de los compuestos bioquímicos.

3. El oxígeno desempeña un papel complejo en el metabolismo microbiano - como nutriente, como aceptor de electrones y como generador de productos tóxicos, Los microorganismos que son capaces de una respiración aeróbica utilizan el oxígeno gaseoso para generar energía.

4. Los compuestos tóxicos que contienen oxígeno son productos del metabolismo aeróbico. Entre ellos se encuentran el peróxido de hidrógeno y los radicales libres superóxido y el radical hidroxilo.

5. Los aerobios estrictos pueden crecer tan sólo en presencia de oxígeno. Los microaerófilos toleran menos oxígeno. Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Los anaerobios aerotolerantes no requieren oxígeno pero no mueren al ser expuestos a él. Los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxígeno.

6. Todos los seres vivos requieren alguna forma de nitrógeno (un constituyente de las proteínas y de los ácidos nucleicos, así como de determinados metabolitos esenciales), de fósforo (un constituyente de los acidos nucleicos, de los fosfolípidos y de ciertos metabolitos esenciales) y de azufre (un componente de dos aminoácidos, de algunos tipos de tRNA, y de determinados metabolitos esenciales).

7. Los elementos traza son compuestos químicos inorgánicos, que se requieren en cantidades pequeñas, aunque son esenciales, tales como el potasio, el hierro y el zinc, que los microorganismos necesitan para crecer. Algunos elementos traza son cofactores.

8. Los factores de crecimiento orgánicos son bloques básicos esenciales. Si un microorganismo no puede sintetizar un determinado bloque básico en particular, debe ser suministrado a partir del ambiente. Los factores de crecimiento orgánicos pueden ser aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos o vitaminas.

9. La diversidad nutricional se refiere a los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgánicos de los microorganismos.

10 Los microorganismos crecen en un ambiente rico, utilizando los bloques básicos preformados, incluso aunque sean capaces de fabricarlos.

El ambiente no nutritivo (pp. 199-203)

1. Cada especie microbiana crece en un intenvalo de temperatura, desde la temperatura mínima de crecimiento a una temperatura máxima de crecimiento. La temperatura óptima de una especie es aquella a la cual crece más rápidamente.

2. Los termófilos crecen mejor a temperaturas superiores a los 50 0C. Los mesófilos crecen mejor a temperaturas cercanas a los 37 ⁰C, la temperatura del cuerpo humano. Los psicrófilos crecen a 5 ⁰C o por debajo de ésta temperatura, la temperatura de un frigorífico.

3. La estabilidad al calor de las proteínas de los microorganismos determina la temperatura máxima a la cual puede crecer. La temperatura minima está determinada por el debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas de las proteínas.

4. La presión hidrostática es la presión que se aplica a un líquido. La mayoría de los microorganismos toleran altas presiones hidrostáticas. Los barófilos crecen mejor (facultativos) o sólamente (estrictos) a presiones superiores a 1 atmósfera.

5. En general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino, y los hongos crecen mejor a un pH ligeramente ácido. Los acidófilos viven en un ambiente con un pH extremadamente bajo, mientras que los alcalófilos viven en ambientes con un pH elevado.

6. Las bacterias mantienen una presión de turgencia positiva. la presión osmótica del interior de la célula es mayor que la presión osmótica de su ambiente externo. Determinadas especies bacterianas, las halófilas, requieren elevadas presiones osmóticas externas.

7. La plasmolisis se produce cuando un incremento en la presión osmotica externa hace que salga agua de la célula, encogiéndose el citoplasma.

MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS (pp. 203-210)

1. Algunos métodos de medida son indirectos, y miden una propiedad la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otros métodos son directos, contando las células individuales.

2. El recuento al microscopio o el recuento electrónico dan un recuento total - un recuento de todas las células, vivas y muertas. Un recuento de viables es un recuento de tan sólo las células vivas, es decir, aquellas que son capaces de reproducirse. El recuento en placa y el NMP son recuentos de viables.

3. La turbidez se mide con un espectrofotómetro. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite un cultivo líquido de células microbianas. Se utiliza una curva patrón para relacionar las medidas en el espectrofotómetro con la masa celular o con el nómero de células de un cultivo particular.

4. Para la determinación del peso seco se separan las células del medio, se desecan y se pesan.

5. Hay varios procedimientos por los que se puede usar la actividad metabólica para medir el número de células: la tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o ácidos, que produce un cultivo; la tasa de utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa; la tasa de reducción de determinados colorantes.

6.El recuento microscópico sc hace con un porta especial determinado cámara de recuento, como la cámara de Petroff-Hauser .A partir de la prolundidad del pocillo y de la rejilla, se puede determinar el número de células de un volumen determinado de muestra.

7.El recuento electrónico se hace con un contador Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como su medio.

8. En el recuento en placa, se diluye varias veces al décimo o al centésimo una muestra del cultivo, y posteriormente, se inocula o se mezcla en una placa y se incuba. Se seleccionan las placas que tienen entre 30 y 300 colonias y se recuentan.

9. El número más problable <NMP> se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. Después de varias diluciones seriadas al décimo, se incuban los tubos problema. Los tubos que se ponen turbios recibieron una o más células. Determinando la dilución media a la que los tubos no reciben células, se puede calcular, utilizando una tabla del NMP, el número de microorganismos que estaban presentes de manera más probable en la muestra original.

10. La filtración se hace antes de medir un número pequeño de microorganismos en grandes volúmenes de líquido o gas.

PREGUNTAS DE REVISIÓN

LAS POBLACIONES

1. ¿A qué se rofiere el término crecimiento microbiano?

CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS

1. ¿Qué es el tiempo de duplicación? ¿Por qué se usa frecuentemente la tasa de crecimiento, en lugar del tiempo de duplicación?

2. Explique esta frase: los microorganismos crecen exponencialmente.

3. Nombre, secuencialmente, las fases de crecimiento de un cultivo. Explique cada una de ellas.

4. Cómo se mantiene un cultivo continuo en el laboratorio?

5. En condiciones naturales, ¿qué fija normalmente la tasa de crecimiento?

6. Defina el término colonia. Cómo afecta la localizacion en una colonia a la fase de crecimiento de una célula? Cómo afecta la localización al acceso del oxígeno?

¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANIMOS PARA CRECER?

1. ¿Qué son los nutrientes? Explique la función de cada uno de estos nutrientes: carbono, oxígeno, azufre, elementos traza, factores orgánicos de crecimiento.

2. Explique esta frase: el oxígeno juega un papel complejo en el metabolismo microbiano. Utilice el término radical libre en su explicación.

3. Explique las distintas relaciones que tienen con el oxígeno los siguientes tipos de micoorganismos: aerobios obligados, microaerófilos, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes y anaerobios obligados.

4. ¿A qué se refiere la diversidad nutricional?

5. ¿Qué es un ambiente de crecimiento rico? ¿Cómo explotan los microoroanismos un ambiente de crecimiento rico?

6. Nombre los factores físicos significativos para un microorganismo en un ambiente no nutritivo. Nombre los factores químicos más significativos.

7. Explique cómo crecen las distintas especies en un intervalo de temperaturas. Utilice estos términos en su comentario: temperatura mínima de crecimiento, temperatura máxima de crecimiento, teniperatura óptima. Explique qué determina la temperatura maxima y mínima.

8. Defina los siguientes términos: termófilos, mesófilos, psicrólilos.

9. ¿Qué es la presión hidrostática? ¿Por qué los microorganismos pueden soportar elevadas presiones hidrostráticas? ¿Hasta qué punto es perjudicial la presión hidrostática para los microorganismos?

10. ¿Qué valores de pH prefieren las bacterias? ¿Y los hongos? ¿Qué son los acidófilos y los alcalófilos? Si las funciones metabólicas requieren un intervalo de pH relativamente estrecho, cómo pueden las bacterias existir en ambientes con un amplio intervalo de valores de pH?

11. ¿Un qué se diferencian las halófilas de otras bacterias? Cómo mantienen las bacterias la presión de turgencia? ¿Qué es la plasmolisis?

MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS

1. ¿Un qué se diferencian los métodos directos e indirectos de medida de las poblaciones de los microorganismos? ¿Cuál es la diferencia entre un recuento total y un recuento de viables?

2. Indique si cada uno de los siguientes métodos de medida es directo o indirecto y si de un recuento total o de viables; describa el procedimiento y explique las ventajas y desventajas.

a. turbidez

b. peso seco

c. actividad metabólica

d. microscopia directa

e. recuento electrónico directo

f. recuento en placa

g. número más probable (NMP)

h. filtración

Preguntas de ensayo

1. Discuta las ventajas y desventajas del cultivo continuo para la obtención de antibióticos.

2. Discuta el efecto de la riqueza de un medio y de la concentración de un nutriente en la tasa de crecimiento.

LECTURAS RECOMENDADAS

Ingraham, J. L.; Maaloe, O. y Niedhardt, F. C. 1983. Growth of the bacterial cell. Sunderland, Mass: Sinauer.

Kolter, R. 1992. Life and death in stationary phase. ASM News 58:75-79

Marr, A. G. 1991. Growth rate of Escherichia coli. .Microbiological Reviews 55:3l6-33.

Mynell, G. G., y Mynell, E. 1970. Theory and practice in experimental bacteriology. New York: Cambridge University Press.

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