3.1 OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

Como todos los científicos relacionacios con los seres vivos, los microbiólogos necesitan ver los organismos que estudian; esto significa que su herramienta imprescindible es el microscospio. La microscopia, la construccion y el manejo de los microscopios, comenzo en el siglo XVII con Antonie van Leeuwenhoek y su pequeño microscopio de mano.

También, como el resto de los científicos, los microbiólogos necesitan realizar experimentos. La experimentación con microorganismos casi siempre requiere su cultivo en el laboratorio. Cultivar un microorganismo significa proporcionarle las condiciones adecuadas para su crecimiento y multiplicación

En este capítulo se describiran las herramientas y técnicas de un laboratorio de microbiología moderno: los diferentes tipos de microscopios y los métodos para propagar (hacer crecer) los microorganismos en las condiciones artificales del laboratorio.

3.1.1 Las propiedades de la luz

Podemos observar el mundo de nuestro alrededor gracias al cristalino y a la retina de nuestros ojos. El cristalino, en la parte anterior de nuestros ojos, produce imagenes sobre la retina sensible a la luz, en el fondo de los mismos. Pero esta lente del ojo humano necesita la ayuda de las lentes de un microscopio para producir imagenes de los microorganismos. Para entender el funcionamiento de un microscopio, es preciso conocer previamente las propiedades de la luz.

En la naturaleza existe un espectro continuo de ondas electromagnéticas. En un extremo, se encuentran las de más baja frecuencia y mayor longitud de onda, llamadas ondas de radio (Figura 3.1). Las ondas de radio pueden tener una longitud de onda de hasta 2000 metros. En el otro extremo un espectro se encuentran las ondas de más altoa frecuencia y menor longitud de onda, llamadas rayos gamma. Los rayos gamma, producidos en el núcleo de los átomos radiactivos, tienen longitudes de onda inferiores a 0,01 nm (nanómetro), por tanto, menores que un virus.

Figura 3.1 La luz visible corresponde a tan sólo una pequeña parte del espectro electromagnético, el intervalo entre 400 y 700 nm.

Tanto las ondas de radio como los rayos gamma son invisibles. Lo mismo sucede con la mayoría de las ondas del espectro electromágnetico. De hecho, nuestros ojos solamente pueden detectar una pequeña parte de dicho, espectro, la parte que llamamos luz.

Longitud de onda. Las propiedades de las ondas luminosas, así como de todas las ondas electremágneticas, se parecen a las de las olas de los océanos. Las ondas luminosas tienen crestas (puntos altos) y valles (puntos bajos) . La distancia entre dos picos (o dos depresiones) se denomina longitud de onda. Las longitudes de onda de la luz visible se encuentran entre los 400 y los 700 nm, dependiendo del color. La luz azul es la de menor longitud de onda y la roja, la de mayor. La amarilla y la verde poseen valores intermedios. La luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de onda. La luz solar es blanca, pero los colores aparecen cuando se altera por absorción o refracción (se explicará más adelante). La frecuencia de una onda luminusa es igual al número de crestas o valles que pasan a través de un punto particular por segundo. La intensidad de una onda luminosa es la altura de la onda.

Además de describir la luz como ondas, también se puede definir como una corriente de partículas denominadas fotones o como un estrecho haz llamado rayo.

Reflexión, transmisión y absorción. Cuando un rayo de luz incide frontalmente sobre un objeto, pueden suceder tres fenómenos: reflexión, transmisión o absorción. Si el rayo retorna hacia atrás, decimos que se ha reflejado. Si pasa a través del objeto decimos que se ha transmitido y si transfiere parte de su energía a dicho objeto se trata de una abosorción (Figura 3.2).

Figura 3.2 Cuando un rayo de luz incide en un objeto puene reflejarse transmitirse o absorberse.

Los rayos reflejados rebotan en una superficie lisa como lo haría una pelota. Los que indiden perpendicularmente son devueltos directamente hacia atrás. Si llegan al objeto formando un ángulo, son devueltos con el mismo ángulo.

Cunado un rayo de luz indide sobre un objeto transparente, por ejemplo, agua pura en un vaso de cristal, se transmite casi totalmente. Pero si el objeto no es transparente (supóngase un vaso opaco o coloreado), existe absorción de luz. Si todas las longitudes de onda de la luz son absorbidas por igual, la intensidad de la luz disminuye, pero el color no se altera. Sin embargo, si se absorben solo ciertas longitudes de onda, el color de la luz cambia. El color que vemos es el de la luz transmitida o reflejada. Por ejemplo, una solución de un colorante rojo es roja porque absorbe el componente azul de la luz blanca y transmite el componente rojo. Una hoja de una planta es verde porque absorbe el azul y el rojo de la luz solar y refleja el componente verde.

Difracción Cuando la luz pasa a través de una pequeña abertura o cerca de los bordes de un objeto opaco (que no transmite la luz), los rayos se desvían. A este fenómeno se le llama difracción. A causa de la difracción de los rayos de luz, los bordes agudos o los objetos opacos proyectan sombras borrosas. La difracción se debe a la naturaleza ondulatoria de la luz. Consideremos, por ejemplo, las olas de un océano; imaginemos que las olas se acercan a un rompeolas océano a la orilla. Cuando se aproximan, las olas son paralelas. Pero cuando pasan a través de la abertura del rompeolas o cerca de sus extremos, forman semicírculos (Figura 3.3). Los rayos de luz (que son perpendiculares al frente de la onda) se desvían cuando pasan a través de pequeñas aberturas o muy cerca del borde de un obstáculo.

Figura 3.3 La difracción es la desviación que sufren los rayes de luz cuando atraviesan una pequeña abertura o pasan próximos a un obstáculo (cualquier objeto opaco). Las ondas paralelas de luz se extienden -difractan- como sucede con las olas del océano cuando pasan a través de un malecón. Les rayos de luz (flechas), que son perpendiculares al frente de las ondas se desvían.

Refracción La refracción también desvía los rayos de luz, pero mediante un mecanismo diferente. La refracción tiene lugar cuando un rayo de luz incide formando un ángulo sobre un objeto de densidad diferente. Por tanto, en la refracción de la luz están indicados dos factores. Primero, los rayos de luz disminuyen su velocidad cuando penetran en un medio más denso (de aire a agua, por ejemplo). Segundo, cuando la luz penetra en el nuevo medio formando un ángulo, el borde del rayo luminoso que entra primero en la substancia es retardado más que el borde opuesto, que penetra más tarde (Figura 3.4). La magnitud de la refracción, o desviación, depende del ángulo con el cual incide la luz sobre el nuevo medio. A mayor ángulo, mayor refracción. Se llama indice de refracción a la relación que existe entre la velocidad de la luz en el vacío y su velocidad en cualquier otro material. Cuanto mayor es la densidad de un material, mayor índice de refracción posee. Por ejemplo, el indice de refracción del agua pura (a temperatura ambiente) es 1,33, lo que significa que la luz viaja 1,33 veces más despacio en el agua que en el vacio. El índice de refracción del aire es 1,0002.

Los fenómenos de reflexión, transmisión, absorción, difracción y refracción intervienen en la creación de una imagen visible en el microscopio, como se verá en la siguiente sección.

Figura 3.4 Un rayo de luz, de la fuente situada a la izquierda, es reflejado y refractado por el cristal. La refracción tiene lugar cuando la luz entra en un medio más denso que en el que estaba viajando anteriormente. En este caso, la luz se difracta porque el cristal es más denso que el aire.

3.1.2 La microscopia

Utilizamos el microscopio para crear una imagen visible y detallada de algo tan pequeño que no lo podemos visualizar con nuestros propios ojos. Los diferentes tipos de microscopios que existen crean imágenes visibles mediante sistemas distintos, pero en todos los casos, una buena imagen depende de tres factores: aumento, contraste y resolución. Los tres contribuyen a crear una imagen nítida.

Aumento La función más importante de un microscopio es producir el aumento de una imagen. Los microorganismos deben ser ampliados (agrandados) para ser visibles. Los objetos se aumentan con una lente convexa, que es más gruesa en el centro que en los extremos. Una lente convexa desvía los rayos paralelos de luz por refracción hasta hacer que se encuentren en un solo punto, el punto focal. Esta lente crea una imagen aumentada del objeto (Figura 3.5). Se puede obtener un mayor aumente mediante dos sistemas, haciendo la lente más convexa o acercando el objeto al punto focal. Con una lente convexa simple se pueden visualizar microorganismos de hasta 1 µm, como demostró Leeuwenhoek.

Figura 3.5 Una lente convexa produce una imagen aumentada porque desvía los rayos paralelos de luz, haciendo que se encuentren en el punto focal. Esto produce una imagen acimentada del objeto que se encuentra detrás de la lente.

Aunque el aumento es esencial para crear imágenes de objetos pequeños, no es suficiente. Incluso la imagen más grande, si el borrosa, nos dirá muy poco sobre el objeto que deseamos estudiar. Para completar la información es necesario apreciar los detalles. Los dos factores que afectan a nuestra capacidad para percibir los detalles de una imagen son el contraste y la resolución.

Contraste El término contraste se retiere a las diferencias en la intensidad de la luz. Las variaciones en la intensidad de la luz nos permiten apreciar que una zona de la imagen es diferente de otra zona próxima o del fondo de campo. Como ya hemos descrito, parte de la luz que llega a un objeto es absorvida por el mismo, y parte es transmitida (pasa a través del objeto). La imagen que vemos es creada por la luz transmitida. Si un objeto y el medio inmediato que lo rodea transmitieran la misma cantidad de luz, la imagen del objeto se mezclaría con el fondo. Además, si todas las partes de un mismo objeto transmitieran también la misma cantidad de luz, la imagen sería uniforme y carecería de detalles. Por tanto, el contraste es necesario para distinguir un objeto de su fondo y también para percibir los detalles dentro del mismo.

El contraste supone el principal problema a la hora de observar microorganismos, ya que la mayoria de ellos carecen de color y por tanto, transmiten todas las longitudes de onda de la luz visible casí de igual manera. Para obtener una imagen útil de la mayoría de los microorganismos hay que aumentar el contraste de forma artificial. Una forma de aumentar el contraste es colorear los especímenes. En el caso de los microorganismos aplicamos compuestos químicos, denominados colorantes, que tiñen las células o parte de ellas. Algunos tipos de microscopios también pueden incrementar el contraste.

LA MEDIDA DE LOS MICROORGANISMOS

Sabemos que los microorganismos son pequeños, pero "pequeño" es un término relativo. Podríamos decir que el tamaño medio de una bacteria es aproximadamente un millón de veces menor que el de una persona de tamaño medio; pero quizás esta comparación no sea suficientemente descriptiva. ¿Cómo podríamos apreciar su "pequeñez"?

Como todos los científicos, los microbiólogos utilizan el sistema métrico decimal. Este sistema consta de unas unidades básicas, a las cuales se les puede añadir una serie de prefijos que difieren en potencias de diez. Por ejemplo, el metro es la unidad básica de longitud; el litro de volumen; y el gramo de masa. Por tanto, un decímetro (dm) es diez veces menor que el metro; un centímetro (cm), cien veces menor; v un milímetro (mm) es una milésima de metro.

Las dos unidades de medida más usadas para medir los microorganismos son aún más pequeñas. El micrómetro (µm) es la mllonésima parte del metro (1/1000000 ó 10^-6 metros). El nanómetro (nm) es mil millones de veces inferior al metro (1/1000000000 ó 10^-9 metros). Una unidad aún más pequeña es el ángstrom (Å), que es diez mil millones de veces menor que el metro (1/10000000000 ó 10^-10 metros); esta última unidad no forma parte oficialmente del sistema métrico decimal, aunque también se emplea.

Las células de las bacterias, los hongos, las algas y los protozoos se miden en micrómetros. Los virus y las estructuras subcelulares, tales como los ribosomas y las membranas, en nanómetros. Los átomos y moléculas se miden en angstroms.

Resolución: Una buena resolución supone que dos puntos adyacentes de una imagen pueden percibirse separados uno del otro. Si una imagen tiene una resolución pobre, los dos puntos parecerán uno solo. Naturalmente, una imagen con poca resolución aportará pocos detalles. Por ejemplo, un aparato de televisión con alta resolución proporciona una imagen nítida, mientras que en un televisor con pobre resolución se ve borroso. Un mayor aumento no mejora la resolución. Así, una pantalla grande de TV, si éste tiene pobre resolución, simplemente produce una imagen borrosa de mavor tamaño.

A diferencia del contraste, que es una propiedad del objeto que se está estudiando, la resolución es una propiedad del sistema de lentes del microscopio. Se denomina poder de resolución de un microscopio a la menor distancia entre dos puntos adyacentes que pueden ser percibidos por separado uno del otro (ver la descripción de apertura numérica, más adelante). Cuanto más cercanos estén los puntos que pueden ser distinguidos entre si, más detalles podrán ser observados y por tanto serán visibles objetos más pequeños. El poder de resolución depende de tres factores: (1) el tamaño de la primera lente de aumento llamada lente objetivo, (2) la longitud de onda de la luz empleada en la iluminación del espécimen (objeto a ser visualizado), y (3) el indice de refracción del material que se encuentre entre la lente objetivo y el espécimen. Se debe tener en cuenta que un poder de resolución de 4 nm es mayor que uno de 5 nm.

Las lentes de mayor tamaño tienen mayor poder de resolución. Esto se debe a que las lentes grandes permiten que las atraviese un cono de luz mayor. Por tanto, se puede incrementar el poder de resolución -que es siempre la meta- aumentando el tamaño de la lente objetivo. Sin embargo, en la práctica, el tamaño de esta lente en un microscopio siempre está limitado.

¿Cómo influye la longitud de onda de la luz de la fuente del microscopio en el poder de resolución? Recordemos que la luz se difracta (se desvía) cuando pasa a través de pequeñas ranuras o cerca del borde de un objeto opaco y emerge como un semicírculo. Cuando dos puntos se encuentran cercanos uno de otro, producen frentes de onda que tienden a unirse y, por tanto, parecen uno solo, El resultado es una pérdida de detalle. Una solución es iluminar el espécimen con una longitud de onda más corta. Por ejemplo, la luz azul proporciona mayor poder de resolución que la luz roja. Sin embargo, el incremento en el poder de resolución logrado no es grande. Para aumentarlo por un factor considerable, se usan ondas electromagnéticas con una longitud de onda mucho más corta que la de la luz visible. Esto explica el alto poder de resolución del microscopio electrónico, que explicaremos más adelante.

El tercer factor que influye en el poder de resolución es el índice de refracción del material existente entre la lente objetivo y el espécimen. Como hemos dicho anteriormente, el índice de refracción y la velocidad de la luz depende de la diferencia de densidad entre dos materiales. Un material con alto índice de refracción disminuye la velocidad de la luz, lo cual incrementa la resolución. Normalmente, el material existente entre el objetivo y la preparación es el aire. El aire posee un índice de refracción de aproximadamente 1,0. Algunas lentes objetivo, denominadas lentes de inmersión, se utilizan sumergidas en aceite (poniendo aceite entre la preparación y el objetivo). Utilizando aceite de inmersión, un fluido viscoso que posee un índice de refracción de 1,5, se aumentará considerablemente la resolución Además no se perderá luz por reflexión fuera de la superficie de la lente objetivo, debido a que el aceite de inmersión y el cristal poseen el mismo índice de refraccion,

Dos de los factores que determinan el poder de resolución -el tamaño de la lente y el uso del aceite de inmersión- son propiedades intrínsecas de la lente. Una medida de esos dos factures, denominada apertura numérica (AN), viene grabada en un lado de la lente objetivo del microscopio. Conociendo la AN y la longitud de onda de la luz de la fuente de un microscopio, se puede calcular la distancia (d) entre dos puntos que pueden observarse como entidades separadas:

 Por ejemplo, si la longitud de onda de la luz azul usada es 450 nm y el valor de la AN es 0,65 (valor normal para una lente de inmersión de alta calidad), la distancia será igual a 346 nm [450/(2 x 0,65) = 346)], es decir, aproximadamente la tercera parte del tamaño de una célula bacteriana de dimensiones medias. Esto significa que no se podrán observar muchos detalles internos en una bacteria.

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